В мировой практике получение семян от свободного опыления для искусственного лесовосстановления возможно с семенных насаждений (seed stands), формируемых на основе отобранных естественных или искусственных насаждений, и с лесосеменных плантаций (seed orchards), создаваемых потомством отобранных генотипов [1]. В России к понятию «семенные насаждения» можно отнести постоянные лесосеменные участки (ПЛСУ) с которых получают семена нормальной селекционной категории. Заготовка семян улучшенной селекционной категории проводится на лесосеменных плантациях 1 порядка (ЛСП). Создание лесосеменных плантаций предполагает улучшение качества и количества семян по сравнению с семенными насаждениями [2]. Однако есть беспокойство о том, что вовлечение в селекционный процесс незначи-тельного количества генотипов при создании ЛСП может привести к снижению генетического разнообразия будущих лесов [3, 4, 5]. Между тем, генетическое разнообразие является одним из важнейших условий, обеспечивающих стабильность популяций, так как именно оно является фактором адаптации вида в изменяющихся условиях окружающей среды [6, 7] и является важным ресурсом для селекционных программ [8]. Поэтому при реализации программ по лесному семеноводству на принципах плюсовой селекции мы не можем не уделять внимание проблеме сохранения генетического разнообразия, так как наши сегодняшние действия определяют, какие насаждения мы будем иметь через50-100 лет.Сравнительные исследования уровня генетического разнообразия лесосеменных плантаций и насаждений хвойных видов с использованием разных типов молекулярных маркеров показали противоречивые результаты. Снижение аллельного разнообразия и уровня гетерозиготности на ЛСП по сравнению с естественными насаждениями было отмечено для Picea glauca x engelmanni [9], Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco [10], Picea glauca (Moench.) Voss и Pinus banksiana Lamb. [11], Pinus sylvestris [12]. По результатам других исследований можно говорить о том, что ЛСП характеризуются сопоставимым или даже более высоким уровнем генетической изменчивости по сравнению с насаждениями [13, 14, 15, 15, 17]. Можно предположить, что уровень генетического разнообразия лесосеменных плантаций обусловлен, прежде всего, индивидуальными генетическими особенностями отобранных плюсовых деревьев. В ряде работ показано, что плюсовые деревья на лесосеменных плантациях могут содержать очень высокий запас генетической изменчивости [18, 19]. Таким образом, оценка генетического разнообразия отобранных плюсовых деревьев и созданных на их основе лесосеменных плантаций часто становится предметом научных изысканий. В то же время изучению генетического полиморфизма семян древесных видов, получаемых как с лесосеменных плантаций, так и из альтернативных источников, посвящено весьма ограниченное количество исследований. Нам удалось найти только одну работу, в которой для Picea glauca x engelmanni показано, что семена с лесосеменных плантаций характеризуются более высокими значениями доли полиморфных локусов и наблюдаемой гетерозиготности по сравнению как с самими ЛСП, так и с природными популяциями [9].Для исследования были выбраны ISSR-маркеры, в основе которых лежит технология амплификации случайных фрагментов ДНК с использованием неспецифических праймеров. Несомненным преимуществом ISSR-маркеров является то, что они позволяют изучать сразу большое количество расположенных в разных участках генома локусов [20] и тем самым дают возможность отслеживать изменения на уровне нуклеотидов во времени и пространстве. ISSR-маркеры успешно применяются для изучения генетического разнообразия и дифференциации сосны обыкновенной [16, 18, 21, 22, 23, 24].Цель работы – выполнить сравнительную оценку уровня генетической изменчивости и дифференциации семян сосны обыкновенной нормальной и улучшенной селекционных категорий на основе анализа полиморфизма ISSR-маркеров.Материал и методика исследованийДля анализа уровня генетической изменчивости и дифференциации проанализированы партии семян из Пензенской области, Чувашской Республики и Республики Марий Эл нормальной и улучшенной селекционных категорий. Семена нормальной селекционной категории собраны на следующих постоянных лесосеменных участках (ПЛСУ):1) ПЛСУ в Ахунском лесничестве Пензенской области (шифр ПЛСУ ПО);2) ПЛСУ в Порецком лесничестве Чувашской Республики (шифр ПЛСУ ЧР);3) ПЛСУ в Сернурском лесничестве Республики Марий Эл (шифр ПЛСУ РМЭ).Семена улучшенной селекционной категории получены со следующих лесосеменных плантаций (ЛСП):1) ЛСП в Кузнецком лесничестве Пензенской области (шифр ЛСП ПО);2) 1 поле ЛСП в Ибресинском лесничестве Чувашской республики (шифр ЛСП 1 ЧР);3) 2 поле ЛСП в Ибресинском лесничестве Чувашской республики (шифр ЛСП 2 ЧР);4) ЛСП в Сернурском лесничестве Республики Марий Эл (шифр ЛСП РМЭ).Для генетического анализа использовали проростки 30 случайных семян из среднего образца. ДНК выделяли с применением СТАВ-метода [25]. Характеристика ISSR-праймеров, примененных при полимеразной цепной реакции, представлена в табл. 1. Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием набора реактивов «Encyclo PCR kit» (Evrogen, Россия) и термоциклера MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 мкл ПЦР буфер; 0,2 мкл dNTPs (по 10мМ каждого); 0,1 мкл прймера (100мк М); 0,1 мкл Taq-полимеразы (2 ед/мкл); 1 мкл препарата ДНК и 7,6 мкл стерильной воды. Режим ПЦР: первоначальная денатурация в течение 5 мин при температуре 94 ºС; 45 циклов – денатурация в течение 30 с при 94 ºС, отжиг праймеров в течение 45 с при 60 ºС и элонгация в течение 2 мин при 72 ºС; финишная элонгация в течение 7 мин при 72 ºС. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов выполнено в 1,5 % агарозном геле с использованием ТВЕ-буфера при напряжении 80 V. В качестве стандарта использовали маркер длин ДНК «100+ bp DNA Ladde» (Evrogen, Россия). Расчет длин амплифицированных фрагментов ДНК выполнен с применением системы гель-документирования GelDoc 2000 и программы Quantity One® Version 4.6.3. Расчет показателей генетического разнообразия и дифференциации выполнен в программе PopGenе.Результаты и обсуждениеISSR-праймеры относятся к мульти-локусным типам ДНК-маркеров, при использо-вании которых одновременно амплифицируется множество фрагментов ДНК. Использованные в исследовании ISSR-праймеры позволили идентифицировать от 24 до 41 локусов (табл. 1). Всего во всей выборке было обнаружено 215 локусов, при этом 210 локусов (99,7 %) оказались полиморфными. Только 5 ПЦР-фрагментов встречались абсолютно у всех семян в каждой партии. Длина ПЦР-фрагментов варьировалась от 200 до 2790 пар нуклеотидов. Доля полиморфных локусов является одним из показателей генетического разнообразия. Популяция называется полиморфной по ISSR-локусу, если в ней встречается два варианта аллелей: вариант «1» означает, что ПЦР-фрагмент определенной длины присутствует, вариант «0» означает отсутствие этого ПЦР-фрагмента. Количество полиморфных локусов варьировалось от 56,3 до 72,6 % у семян улучшенной селекционной категории и от 57,2 до 68,4 % у семян нормальной селекционной категории (табл. 2).Обращают на себя внимание более низкие значения количества полиморфных локусов по сравнению с данными, полученными ранее с использованием аналогичных ISSR-праймеров для ЛСП и насаждений из тех же географических районов, для которых значения этого параметра находились в пределах от 77,2 до 91,2 % [16]. При использовании другого набора ISSR-праймеров для изучения генетического разнообразия популяций сосны обыкновенной установлено, что процент полиморфных локусов для разных популяций может варьироваться от 27 до 78 [21, 23, 24]. В целом для всех семян 97,7 % ISSR-локусов относятся к полиморфным, отдельно по селекционным категориям данный показатель составил 94,4 % и 94,9 %. Таблица 1Характеристика использованных ISSR-праймеровISSR-праймерНуклеотидная последовательность праймеровКоличество локусовПроцент полиморфных локусовРазмеры ПЦР-фрагментов, п.н.всегов т.ч. поли-морфных(СA)6AGCTCACACACACACAAGCT3939100,0200 – 2300(СA)6AGCACACACACACAAGG414097,6200 – 2550(CA)6GTCACACACACACAGT353497,2210 – 2200(CA)6АCCACACACACACAAC373697,3210 – 2500(AG)8TAGAGAGAGAGAGAGAGT242395,8210 – 1340(AG)8GCTAGAGAGAGAGAGAGAGGCT3939100,0210 – 2790Всего 21521097,7200 – 2790Собственные экспериментальные данныеТаблица 2Показатели генетического полиморфизма семян сосны обыкновеннойИсточниксемянПроцент полиморфных локусов, РЧисло аллелей на локус, NaЭффективное числоаллелей, NeОжидаемая гетерозиготность, НеУлучшенные семенаЛСП ПО72,61,731,260,17ЛСП 1 ЧР 56,31,561,320,19ЛСП 2 ЧР64,21,641,380,23ЛСП РМЭ59,51,591,280,17Для всех ЛСП94,91,951,390,25Нормальные семенаПЛСУ ПО72,61,681,250,17ПЛСУ ЧР61,41,611,330,19ПЛСУ РМЭ57,21,571,260,16Для всех ПЛСУ94,41,941,340,22Для всех семян97,71,981,380,24Собственные вычисления в программе PopGene  Для разных партий семян показатели генетического разнообразия изменялись в следующих пределах: число аллелей на локус от 1,56 до 1,73; эффективное число аллелей от 1,25 до 1,38; ожидаемая гетерозиготность от 0,16 до 0,23. Наибольшим аллельным разнообразием характеризуются семена с ЛСП и ПЛСУ из Пензенской области, для которых отмечены наибольшие значения числа аллелей на локус. Самые высокие значения эффективного числа аллелей и ожидаемой гетерозиготности были установлены для улучшенных семян с 2 поля ЛСП из Ибресинского лесничества Чувашской Республики. Более низким аллельным разнообразием характеризуются улучшенные семена, полученные с 1 поля ЛСП Ибресинского лесничества Чувашской Республики, и нормальные семена, заготовленные на ПЛСУ Сернурского лесничества РМЭ. Самый низкий уровень ожидаемой гетерозиготности обнаружен также у семян с ПЛСУ Сернурского лесничества РМЭ.Какой-либо зависимости уровня генетической изменчивости семян от их селекционной категории не прослеживается, так как и среди улучшенных, и среди нормальных семян встречаются партии с относительно высокими и относительно низкими значениями показателей генетического разнообразия. Данный вывод вполне прогнозируем, исходя из предположения, что ISSR-маркеры являются селективно нейтральными и селекционный отбор плюсовых деревьев не должен приводить к снижению показателей генетического разнообразия. Можно предположить, что уровень генетического разнообразия обусловлен, прежде всего, не селекционным происхождением, а индивидуальными генетическими особенностями деревьев, участвующих в образовании пула семян. Генетическое разнообразие партий семян также зависит от размера родительской популяции, баланса по репродуктивной вкладу родителей, степени родства родителей и уровня инбридинга [26].Значения обобщенных показателей генетического разнообразия для улучшенных семян оказались немного выше, чем для нормальных: так, число аллелей на локус составило 1,95 против 1,94; эффективное число аллелей 1,39 против 1,34; ожидаемая гетерозиготность 0,25 против 0,22. Ранее для ЛСП из Республики Марий Эл, Чувашской Республики и Пензенской области также были установлены более высокие значения показателей разнообразия по сравнению с насаждениями из тех же субъектов РФ: эффективное число аллелей 1,43 для ЛСП и 1,39 для насаждений; ожидаемая гетерозиготность 0,27 для ЛСП и 0,25 для насаждений [16].Наиболее генетически близкими являются улучшенные и нормальные семена из Пензенской области (ЛСП ПО и ПЛСУ ПО), генетическая дистанция Нея между данными партиями семян составила 0,027. Наибольшая генетическая дистанция Нея, равная 0,113, выявлена между двумя парами семян: 1) улучшенные семена с 1 поля Ибресинского лесничества Чувашской Республики (ЛСП 1 ЧР) и улучшенные семена из Республики Марий Эл (ЛСП РМЭ); 2) нормальные и улучшенные семена из Республики Марий Эл (ПЛСУ РМЭ и ЛСП РМЭ). Дендрограмма генетического взаимоотношения показывает, что отдельный кластер составили улучшенные семена с 1 поля ЛСП Ибрсинского лесничества Чувашской Республики (ЛСП 1 поле ЧР) и нормальные семена с ПЛСУ Сернурского лесничества Республики Марий Эл (ПЛСУ РМЭ) с генетической дистанцией Нея между ними 0,077. Следовательно, эти партии семян характеризуются близкой генетической структурой. Все остальные партии семян вошли во второй большой кластер, генетическая дистанция Нея между партиями семян этого кластера варьировала от 0,27 до 0,99.Улучшенные и нормальные семена из Пензенской области, Чувашской Республики и Республики Марий Эл характеризуются большей генетической дифференциацией по сравнению с лесосеменными плантациями и насаждениями из тех же географических районов. Во всех трех географических районах генетическая дистанция Нея, установленная между улучшенными и нормальными семенами, оказалась больше, чем генетическая дистанция между ЛСП и насаждениями (табл. 3). Рис. 1. Дендрограмма, иллюстрируящая генетическое взаимоотношения между партиями семян сосны обыкновеннойДендрограмма, построенная на собственных экспериментальных данных в программе PopGene Таблица 3Показатели генетической дифференциации семян сосны обыкновенной разных селекционных категорий Географическоепроисхождение семянГенетическая дистанция Неяулучшенные и нормальные семенаЛСП и насажде-ния*Пензенская область0,0270,011Чувашская Республика0,085-0,1090,038Республика Марий Эл0,1330,065Показатель генетической подразделенности выборок, Gst0,2500,127* Данные Т.Н Криворотовой и О.В. Шейкиной [16]Собственные данные Показатель генетической подразделённости также свидетельствует о том, что семена имеют большую долю генетического разнообразия, приходящегося на изменчивость между партиями семян, чем выборки деревьев из насаждений и ЛСП (0,250 против 0,127). Значение генетической подразделенности выборок показывает, что большая часть генетического разнообразия сосредоточена внутри партий семян (75 %), в то время как на изменчивость между партиями семян приходится 25 %. Для сосны обыкновенной с использованием разных видов молекулярных маркеров ранее также были установлены большие значения внутрипопуляционной компоненты генетического разнообразия по сравнению с межпопуляционной [16, 21, 22, 24].ЗаключениеМировые исследования показали, что искусственное восстановление лесов может приводить как к увеличению, так и к снижению уровня генетического разнообразия новых насаждений [1]. Каким будет генетическое разнообразие наших будущих искусственных лесов, в большой степени зависит от генетической изменчивости репродуктивного материала, использованного при лесовостановлении. В нашей работе показано, что уровень генетического разнообразия не зависит от селекционной категории семян, а обусловлен, прежде всего, индивидуальными особенностями участвующих в формировании урожая родительских деревьев. Улучшенные семена, полученные на лесосеменных плантациях, могут характеризоваться даже более высоким уровнем генетического разнообразия по сравнению с семенами нормальной селекционной категории. Необходимо на научной основе подходить к проектированию лесосеменных плантаций, обеспечивающих не только получение семян с хорошими наследственными и посевными качествами, но и сохранение генетического разнообразия.  Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках выполнения базовой части государственного задания высшим учебным заведениям и научным организациям в сфере научной деятельности (г/б НИР 37.8531.2017)